Niniejszy tekst ma za zadanie przybliżyć pacjentowi metodę analizy DNA oraz RNA jaką jest PCR.
Z ang. polymerase chain reaction, co nadal niczego Laikowi nie tłumaczy…
Technikę PCR wykorzystuje się powszechnie w testach, które mają za zadanie:
- znaleźć ściśle określony patogen w badanej próbce, np. Chlamydię trachomatis w moczu czy pałeczkę krztuśca w wymazie z gardła.
- Określić z jakim szczepem mamy do czynienia, przydatne gdy walczymy np. z infekcją E. coli oporną na standardowe leczenie
- badanie DNA w poszukiwaniu konkretnych wariantów genów i ich mutacji, określanie predyspozycji do chorób uwarunkowanych genetycznie lub potwierdzenie choroby uwarunkowanej genetycznie
Dlaczego wynik testów PCR ma znaczenie:
- pozwala dobrać właściwe leki i szybciej uporać się z infekcją
- pozwala ukierunkować terapię w przypadku chorób przewlekłych
- wysoka czułość i specyficzność testu gwarantuje wiarygodny wynik
Czułość testu to zdolność do wykrycia poszukiwanego czynnika chorobotwórczego lub wariantu genetycznego.
Specyficzność to pewność, że wykryty czynnik lub wariant gen. jest dokładnie tym, którego poszukujemy. Tzn. pozytywny test na Chlamydię trachomatis stwierdza obecność w próbce DNA Chlamydii trachomatis, nie Chlamydii pneumonie czy Mycoplasmy pneumoniae. Nie ma możliwości „pomyłki”*.
*Laboratoria medyczne mają obowiązek używać certyfikowanych zestawów testów, które przeszły walidację, a ich czułość i specyficzność została gruntownie sprawdzona i potwierdzona niezależnym testem innego producenta.
Na czym polega technika PCR?
Badanie PCR polega na wielokrotnym powieleniu (zwykle w 30-40 cyklach) specyficznego fragmentu DNA, np. genów kodujących białka krętka Borreli, za pomocą enzymu polimerazy.
Następnie w celu uwidocznienia namnożonego fragmentu DNA stosuje się specjalne barwniki molekularne, których sygnał odczytywany jest na żelu agarozowym (zwykły PCR) lub specjalistycznym aparacie (Real-Time PCR).
PCR, dzięki powielaniu określonych fragmentów DNA, jest metodą ultraczułą.
Etapy badania:
- Izolacja materiału genetycznego z badanego materiału
- przygotowanie reakcji PCR (zwykle mix kilku odczynników dodanych w ściśle określonych proporcjach)
- Właściwa reakcja PCR (na specjalistycznym aparacie)
- Odczyt reakcji i analiza wyników
Kiedy wybrać test PCR, a kiedy tradycyjne badanie na obecność przeciwciał?
Diagnostyka metodą PCR umożliwia szybkie i precyzyjne wykrycie patogenów, w tym trudnych do hodowli tradycyjnymi metodami mikrobiologii. Umożliwia zatem wykrycie patogenów, których nie udało się wychodować na pożywkach mikrobiologicznych czy zaobserwować pod mikroskopem w preparacie bezpośrednim.
Umożliwia wykrycie patogenów w tzw. okienku serologicznym, tzn. czasie, w którym nie doszło jeszcze do wykształcenia odpowiedzi immunologicznej organizmu na obecność patogenu.
Wynik testu PCR daje odpowiedź na pytanie: czy w danej chwili w badanym materiale występują określone drobnoustroje lub pasożyty (szukamy ich „fizycznej obecności” w postaci śladu DNA/RNA).
Natomiast wyniki testów serologicznych (np. IgM, IgG) oparte są na obecności przeciwciał, tzn. odpowiedzi organizmu na styczność z patogenem. Ta styczność mogła mieć miejsce rok, miesiąc, tydzień wcześniej i wcale nie znaczy o tym, że patogen nadal jest obecny w naszym organizmie. Styczność z patogenem nie musi zawsze skutkować zachorowaniem. Uzależnione jest to od wielu czynników, m.in. od poziomu odporności człowieka.
PCR – wyniki. Czy mogą być fałszywie dodatnie?
PCR jest metodą ultraczułą i jednocześnie bardzo wrażliwą na zanieczyszczenia. Dlatego bardzo istotne w testach opartych o PCR jest dobranie odpowiedniej kontroli wewnętrznej w celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich.
Kluczowe również jest prawidłowe pobieranie materiału do badań oraz doświadczenie i rzetelność pracy diagnosty wykonującego badanie.
PCR – wyniki. Czy mogą być fałszywie ujemnie?
Jak w każdym badaniu laboratoryjnym również w metodzie PCR mogą pojawić się wyniki fałszywie ujemne. Najczęstszą przyczyną wyników fałszywie ujemnych jest błąd przedlaboratoryjny, np. niewłaściwe pobranie materiału, niewłaściwy materiał do badania, nieprawidłowe warunki przechowywania materiału.
Kluczowe jest pobranie materiału, np. krwi na odpowiedni antykoagulant, ponieważ niektóre z nich jak heparyna mogą zahamować reakcję PCR.
Również pobranie materiału po rozpoczęciu antybiotykoterapii może powodować spadek wydajności reakcji PCR oraz większe prawdopodobieństwo pojawienia się wyników fałszywie ujemnych. O takich sytuacjach należy powiadomić laboratorium przed pobraniem materiału i upewnić się czy w danych przypadku materiał będzie nadawał się do analizy.